Potential vätgas , eller pH , är ett mått på hur sur eller basisk en vätska . Det är viktigt inom många områden , bland annat biologi , kemi och miljövetenskap . Mätning av pH är enkel i de flesta situationer. Lackmuspapper kan införas i fluiden, och förändringen i färgen på papperet identifierar den grad i vilken vätskan är syra eller bas. I de fall där vätskan som skall testas är inom en cell , men andra metoder måste vara devised.Things Du behöver
2 ’, 7’- bis- ( 2 = karboxietyl) -5 ( och -6 ) – karboxifluorescein ( BCECF ) , eller annan substans som har varierande fluorescens under olika pH-förhållanden
fluorescensspektrofotometer med dubbla monokromatorer , eller liknande instrument för mätning av fluorescens
Centrifug
Förutbestämda kalibreringskurvor som mäter korrelation av intracellulär BCECF och cytoplasmatisk pH
Visa fler instruktioner
en
Cool temperaturen i provcellen till 41 till 50 grader Fahrenheit. Detta möjliggör en bättre absorption av det fluorescerande materialet av cellerna .
2
Ladda provcellen med en fluorescens framkallande substans såsom BCECF . Detta görs genom att lägga till BCECF till cellmedietoch sedan röra om blandningen försiktigt under 2,5 timmar. Den BCECF absorberas genom membran i cellerna . Addera 3
Separera cellerna från mediet och eventuellt icke absorberat BCECF genom att köra provet genom en centrifug . Sätt cellerna i en separat behållare .
4
Värm provcellen till 98,6 grader Fahrenheit i 30 minuter , för att närma villkoren i den mänskliga kroppen . Om cellerna undersökta lever normalt i annan miljö än den mänskliga kroppen , justera urvalet till lämplig temperatur .
5
Excite provcellengenom omrörning . Detta bidrar till att öka den fluorescerande aktiviteten .
6
Mät fluorescensintensitet av provcellen med en spektrofotometer . För bästa resultat , använd excitation ljus vid våglängderna 500 till 510 nanometer . Vid dessa våglängder , det finns en större spridning av fluorescensintensitet , så det är lättare att differentiera resultaten. Den fluorescerande intensitet mäts i relativa fluorescerande enheter ( RFU ) , en kvot av ljusstyrkan på ämnet i en upphetsad , fluorescerande tillstånd till sitt normala , unexcited tillstånd . Ju högre RFU , desto ljusare ämnet , i jämförelse till sitt normala tillstånd .
7
Jämför spektrofotometer resultat till redan dragen kalibreringskurvor . I allmänhet högre fluorescerande betyder högre pH i provet. Med en excitationsvåglängd av 510 nm , skulle en substans med ett pH av 6,4 visar en RFU av omkring 20 , medan ett ämne med ett pH-värde av 9,9 skulle visa en RFU av ca 55 . Addera