Den patch-clamp experiment används för att mäta enskilda levande celler . Det gör detta med en mycket fin pipett höll tätt mot den enda cellens membran ( det yttre skyddsöverdrag ) . Öppnandet av denna pipett är endast ca 1 mikrometer (en tusendels millimeter ) och styrs optiskt med ett mikroskop . Cellerna hålls jämn i en skål med hjälp av en cell detacher , såsom trypsin . Ett specifikt cell väljs och pipettspetsen är placerad på cellmembranet. En tät försegling bildas med användning av sugning och en del av membranet dras in i pipette.Things Du behöver
Cell plattan
fosfatbuffrad saltlösning eller PBS (utan kalcium och magnesium ) katalog Trypsin
Incubator
10 – milliliter pipett
HEK ( human epidermal keratinocyctes ) medium
fetalt kalvserum ( FCS ) katalog Centrifug
extern inspelningslösning
Patch clamp chip
Twist lock
Elektrod
Visa fler Instruktioner
1
Skaffa en platta för celler . Tvätta plattan två gånger med 10 ml PBS ( fosfatbuffrad saltlösning) utan kalcium och magnesium. Tillsätt 2 ml av detacher ( trypsin ) . Inkubera plattan under tre minuter vid 37 grader Celsius. Observera plattan under mikroskop för att säkerställa att cellerna har lossnat. Rör försiktigt på plattan för att lösgöra alla cellerna från bottnen av plattan. Tillsätt 10 ml av HEK ( humana epidermala keratinocyctes ) och FCS medium ( foster ko serum ) . Använd en 10 – milliliter pipett för att flytta cellerna upp och ner .
2
Observera cellerna under mikroskop för att se till att de är enskilda celler . Pipettera med användning av 10 – ml- pipett tills cellerna är enkel, om det behövs. Centrifugera cellerna under två minuter vid 1000 varv per minut. Kasta bort supernatanten . Placera cellerna i 10 ml fetalt kalvserum. Centrifugera cellerna igen i två minuter vid 1000 varv per minut. Kasta bort supernatanten . Placera cellerna i 200 mikroliter av externa inspelningslösning . Observera cellerna under mikroskop för enstaka celler med en slät membran . Addera 3
Placera saltlösning i en patch clamp chip . Tillsätt en droppe av intracellulär elektrolytlösning till bottendelen av chipet med användning av en pipett. Montera chip på en roterande topp . Vridlocket skall innehålla referenselektroden och sugledningen. Tillsätt en droppe av extracellulär elektrolytlösning till toppen av chipet med användning av en pipett. Elektrolytlösningen medger chipet för att få kontakt med elektroden. Lägg 5 mikroliter av cellsuspension till saltlösningen i chippet . Placera en enda cell med användning av sugning genom en pipett. Sug kan utföras manuellt genom att suga luft genom pipett. Placera cellen ökar motstånd för att bilda en tätning. Tätningen tillåter undersökning av hela cellen . Addera